Geenidiagnostiikassa k\u00e4yt\u00e4mme yleisesti kaupallisesti saatavissa olevia reagensseja ja laitteita. Kaikki k\u00e4ytt\u00e4m\u00e4mme menetelm\u00e4t ovat laboratoriossamme testattuja ja validoituja soveltuviksi diagnostiseen k\u00e4ytt\u00f6\u00f6n. Menetelmien suorituskyky\u00e4 seuraamme jatkuvasti mm. hy\u00f6dynt\u00e4m\u00e4ll\u00e4 kaupallisia kontrollin\u00e4ytteit\u00e4 (NGS) ja osallistumalla ulkoisiin laaduntarkkailukierroksiin s\u00e4\u00e4nn\u00f6llisesti (TaqMan\u00ae-, MLPA\u00ae-menetelm\u00e4t, PKD1-, PKD2- ja CYP21OH-geenitutkimukset sek\u00e4 tulosten tulkinta n\u00e4iden osalta).
Analyysit perustuvat RefSeq-tietokannan (https:\/\/www.ncbi.nlm.nih.gov\/refseq\/) ihmisen genomin proteiinia koodaaviin alueisiin ja ne kattavat joko LRG (https:\/\/www.lrg-sequence.org\/) tai RefSeq-geenien transkriptit. Analyysien mahdolliset poikkeavuudet n\u00e4ist\u00e4 referensseist\u00e4 ilmoitamme tutkimuskuvauksissa verkkosivuillamme.
Raportoitavat variantit varmistamme uudelleen eristetyst\u00e4 DNA:sta toisella riippumattomalla menetelm\u00e4ll\u00e4, mik\u00e4li sellainen on saatavilla.<\/p>\n\n\n\n
N\u00e4ytemateriaali<\/strong> DNA:n eristys<\/strong> TaqMan\u00ae-menetelm\u00e4<\/strong> Sangerin sekvensointimenetelm\u00e4<\/strong> Uuden sukupolven sekvensointi<\/strong> MLPA-menetelm\u00e4\/deleetioanalyysi<\/strong> Koettimien kohdealueet l\u00f6ytyv\u00e4t kitin valmistajan verkkosivuilta (https:\/\/www.mrcholland.com, 06.10.2020) ja tarkempia tutkimuskohtaisia tietoja saa pyydett\u00e4ess\u00e4 It\u00e4-Suomen Genomikeskuksen Geenidiagnostiikkalaboratoriosta<\/a>.<\/p>\n\n\n\n Tulosten tulkinta<\/strong>
Monogeenisten sairauksien ja farmakogenomiikan diagnostisia tutkimuksia varten otamme vastaan EDTA-kokoverta tai valmiiksi eristetty\u00e4 DNA:ta. MLPA-analyyseja varten pyyd\u00e4mme l\u00e4hett\u00e4m\u00e4\u00e4n EDTA-kokoverta.<\/p>\n\n\n\n
Genominen DNA eristet\u00e4\u00e4n EDTA-kokoverest\u00e4 QIAamp\u00ae DNA Blood -kitill\u00e4 (QIAGEN). Menetelm\u00e4 sopii sek\u00e4 tuoreelle ett\u00e4 pakastetulle verelle. Laboratoriossamme eristetyn tai valmiiksi eristettyn\u00e4 vastaanotetun kaksijuosteisen genomisen DNA:n puhtaus, laatu ja pitoisuus tarkastetaan fluorometrisesti ennen geneettisi\u00e4 analyysej\u00e4.<\/p>\n\n\n\n
Valtavariantit analysoidaan k\u00e4ytt\u00e4en TaqMan\u00ae-kemiaa (Thermo Fisher Scientific). TaqMan\u00ae-menetelm\u00e4\u00e4 varten jokaiselle analysoitavalle variantille on suunniteltu spesifiset alukkeet ja koettimet.
Suunnitteluprosessissa huomioidaan toistojaksot ja tunnetut sekvenssimuutokset, jolla estet\u00e4\u00e4n n\u00e4iden vaikutus analyysitulokseen. T\u00e4m\u00e4 ei kuitenkaan poista raportoimattomien harvinaisten muutoksien aiheuttamia vaikutuksia.
TaqMan\u00ae-menetelm\u00e4 soveltuu vain ennalta m\u00e4\u00e4ritettyjen genotyyppien, esimerkiksi yhden nukleotidin muutosten sek\u00e4 lyhyiden insertioiden ja deleetioiden analysoimiseen. TaqMan-menetelm\u00e4 soveltuu my\u00f6s heteroplasmisen n\u00e4ytteen analyysiin Sanger-sekvensointia luotettavammin.<\/p>\n\n\n\n
Tutkittavat alueet monistetaan PCR-menetelm\u00e4ll\u00e4 ja analysoidaan kapillaarisekvensoinnilla k\u00e4ytt\u00e4en Sangerin sekvensointimenetelm\u00e4\u00e4 (Thermo Fisher Scientific). PCR-monistuksessa k\u00e4ytett\u00e4vien alukkeiden suunnittelussa otetaan huomioon toistojaksot ja tunnetut sekvenssimuutokset sek\u00e4 muut monistumiseen mahdollisesti vaikuttavat tekij\u00e4t.
Sangerin sekvensointimenetelm\u00e4 soveltuu yhden nukleotidin muutosten sek\u00e4 lyhyiden insertioiden ja deleetioiden analysoimiseen. Menetelm\u00e4ll\u00e4 ei havaita tutkittavan alueen ulkopuolisia muutoksia. Alukkeiden sitoutumisalueella olevat muutokset voivat johtaa vain toisen juosteen monistumiseen, jolloin mahdollinen muutos tutkittavalla alueella j\u00e4\u00e4 havaitsematta tai se havaitaan homotsygoottisena. GC-rikkaus ja toistojaksot tutkittavalla alueella voivat est\u00e4\u00e4 luotettavan tuloksen saamisen.<\/p>\n\n\n\n
Uuden sukupolven sekvensoinnit (Next Generation Sequencing, NGS) suoritetaan Illuminan laitteilla, jotka k\u00e4ytt\u00e4v\u00e4t Sequencing by Synthesis (SBS) -kemiaa. NGS-sekvensoinnilla sekvensoidaan kohdistetusti tarjottujen geenipaneelien sis\u00e4lt\u00e4mien geenien eksoni- ja eksonien reuna-alueet (v\u00e4hint\u00e4\u00e4n 5 em\u00e4st\u00e4) (UCSC hg19).
NGS-sekvensointi perustuu massiiviseen rinnakkaissekvensointiin, jossa miljoonia lyhyit\u00e4 DNA-fragmentteja monistetaan samanaikaisesti. Sekvensoidut fragmentit rinnastetaan ihmisen referenssisekvenssiin, jolloin siit\u00e4 poikkeavat em\u00e4kset voidaan tunnistaa. Geenipaneelien sekvensointiin n\u00e4ytteet valmistetaan kaupallisilla kiteill\u00e4, joilla genominen DNA pilkotaan ja halutuilta genomin alueilta per\u00e4isin olevat fragmentit rikastetaan NGS-sekvensointia varten.
Menetelm\u00e4 soveltuu yhden nukleotidin muutosten sek\u00e4 lyhyiden insertioiden ja deleetioiden havaitsemiseen.<\/p>\n\n\n\n
MLPA-menetelm\u00e4n k\u00e4ytt\u00f6 deleetioanalytiikassa perustuu tutkittavan geenin eksonien kopioluvun tai tunnettujen varianttien genotyypin m\u00e4\u00e4ritt\u00e4miseen. Deleetioanalyysit tehd\u00e4\u00e4n fragmenttianalyysiin tarkoitetulla kapillaarisekvensointilaitteella ja kaupallisella Multiplex-PCR-menetelm\u00e4\u00e4n pohjautuvalla kitill\u00e4 (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification, MLPA\u00ae, MRC-Holland).
Analyysi soveltuu deleetioiden lis\u00e4ksi tutkittavalla alueella esiintyvien muiden kopiolukumuutosten ja kitin valmistajan ennalta m\u00e4\u00e4rittelemien varianttien genotyyppaukseen.
MLPA-menetelm\u00e4 on herkk\u00e4 DNA:n laadulle ja eristyksess\u00e4 k\u00e4ytetylle puskurille, joten suosittelemme analyysiin EDTA-kokoverta valmiiksi eristetyn DNA:n sijasta.
MLPA-menetelm\u00e4ll\u00e4 ei havaita seuraavanlaisia muutoksia:<\/p>\n\n\n\n\n
Sekvensoinnissa ja deleetioanalytiikassa havaittuja sekvenssimuutoksia verrataan tietokannoista ja kirjallisuudesta l\u00f6ytyviin aikaisemmin raportoituihin sekvenssimuutoksiin niiden patogeenisyyden arvioimiseksi. Variantit luokitellaan ACMG suositusten mukaisesti (Richards et al., 2015).
Tutkimusvastauksessa raportoimme l\u00f6ydetyt variantit, jotka ovat patogeenisia tai todenn\u00e4k\u00f6isesti patogeenisia (pathogenic, likely pathogenic) tai merkitsevyydelt\u00e4\u00e4n ep\u00e4varmoja (uncertain significance). Neutraaleiksi (likely benign, benign) arvioituja sekvenssimuutoksia ei raportoida. Varianttien luokittelu voi muuttua uuden lis\u00e4\u00e4ntyv\u00e4n tiedon my\u00f6t\u00e4, jolloin tiedotamme asiasta hoitavia l\u00e4\u00e4k\u00e4reit\u00e4.
Tunnetut suomalaisille tyypilliset valtavariantit ovat aiemmin kirjallisuudessa todettu patogeeniseksi.
Tutkimusvastaus toimitetaan l\u00e4hett\u00e4v\u00e4lle l\u00e4\u00e4k\u00e4rille.<\/p>\n\n\n\n