Menetelmät

Geenidiagnostiikassa käytämme yleisesti kaupallisesti saatavissa olevia reagensseja ja laitteita. Kaikki käyttämämme menetelmät ovat laboratoriossamme testattuja ja validoituja soveltuviksi diagnostiseen käyttöön. Menetelmien suorituskykyä seuraamme jatkuvasti mm. hyödyntämällä kaupallisia kontrollinäytteitä (NGS) ja osallistumalla ulkoisiin laaduntarkkailukierroksiin säännöllisesti (TaqMan®-, MLPA®-menetelmät, PKD1-, PKD2- ja CYP21OH-geenitutkimukset sekä tulosten tulkinta näiden osalta).
Analyysit perustuvat RefSeq-tietokannan (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/) ihmisen genomin proteiinia koodaaviin alueisiin ja ne kattavat joko LRG (https://www.lrg-sequence.org/) tai RefSeq-geenien transkriptit. Analyysien mahdolliset poikkeavuudet näistä referensseistä ilmoitamme tutkimuskuvauksissa verkkosivuillamme.
Raportoitavat variantit varmistamme uudelleen eristetystä DNA:sta toisella riippumattomalla menetelmällä, mikäli sellainen on saatavilla.

Näytemateriaali
Monogeenisten sairauksien ja farmakogenomiikan diagnostisia tutkimuksia varten otamme vastaan EDTA-kokoverta tai valmiiksi eristettyä DNA:ta. MLPA-analyyseja varten pyydämme lähettämään EDTA-kokoverta.

DNA:n eristys
Genominen DNA eristetään EDTA-kokoverestä QIAamp® DNA Blood -kitillä (QIAGEN). Menetelmä sopii sekä tuoreelle että pakastetulle verelle. Laboratoriossamme eristetyn tai valmiiksi eristettynä vastaanotetun kaksijuosteisen genomisen DNA:n puhtaus, laatu ja pitoisuus tarkastetaan fluorometrisesti ennen geneettisiä analyysejä.

TaqMan®-menetelmä
Valtavariantit analysoidaan käyttäen TaqMan®-kemiaa (Thermo Fisher Scientific). TaqMan®-menetelmää varten jokaiselle analysoitavalle variantille on suunniteltu spesifiset alukkeet ja koettimet.
Suunnitteluprosessissa huomioidaan toistojaksot ja tunnetut sekvenssimuutokset, jolla estetään näiden vaikutus analyysitulokseen. Tämä ei kuitenkaan poista raportoimattomien harvinaisten muutoksien aiheuttamia vaikutuksia.
TaqMan®-menetelmä soveltuu vain ennalta määritettyjen genotyyppien, esimerkiksi yhden nukleotidin muutosten sekä lyhyiden insertioiden ja deleetioiden analysoimiseen. TaqMan-menetelmä soveltuu myös heteroplasmisen näytteen analyysiin Sanger-sekvensointia luotettavammin.

Sangerin sekvensointimenetelmä
Tutkittavat alueet monistetaan PCR-menetelmällä ja analysoidaan kapillaarisekvensoinnilla käyttäen Sangerin sekvensointimenetelmää (Thermo Fisher Scientific). PCR-monistuksessa käytettävien alukkeiden suunnittelussa otetaan huomioon toistojaksot ja tunnetut sekvenssimuutokset sekä muut monistumiseen mahdollisesti vaikuttavat tekijät.
Sangerin sekvensointimenetelmä soveltuu yhden nukleotidin muutosten sekä lyhyiden insertioiden ja deleetioiden analysoimiseen. Menetelmällä ei havaita tutkittavan alueen ulkopuolisia muutoksia. Alukkeiden sitoutumisalueella olevat muutokset voivat johtaa vain toisen juosteen monistumiseen, jolloin mahdollinen muutos tutkittavalla alueella jää havaitsematta tai se havaitaan homotsygoottisena. GC-rikkaus ja toistojaksot tutkittavalla alueella voivat estää luotettavan tuloksen saamisen.

Uuden sukupolven sekvensointi
Uuden sukupolven sekvensoinnit (Next Generation Sequencing, NGS) suoritetaan Illuminan laitteilla, jotka käyttävät Sequencing by Synthesis (SBS) -kemiaa. NGS-sekvensoinnilla sekvensoidaan kohdistetusti tarjottujen geenipaneelien sisältämien geenien eksoni- ja eksonien reuna-alueet (vähintään 5 emästä) (UCSC hg19).
NGS-sekvensointi perustuu massiiviseen rinnakkaissekvensointiin, jossa miljoonia lyhyitä DNA-fragmentteja monistetaan samanaikaisesti. Sekvensoidut fragmentit rinnastetaan ihmisen referenssisekvenssiin, jolloin siitä poikkeavat emäkset voidaan tunnistaa. Geenipaneelien sekvensointiin näytteet valmistetaan kaupallisilla kiteillä, joilla genominen DNA pilkotaan ja halutuilta genomin alueilta peräisin olevat fragmentit rikastetaan NGS-sekvensointia varten.
Menetelmä soveltuu yhden nukleotidin muutosten sekä lyhyiden insertioiden ja deleetioiden havaitsemiseen.

MLPA-menetelmä/deleetioanalyysi
MLPA-menetelmän käyttö deleetioanalytiikassa perustuu tutkittavan geenin eksonien kopioluvun tai tunnettujen varianttien genotyypin määrittämiseen. Deleetioanalyysit tehdään fragmenttianalyysiin tarkoitetulla kapillaarisekvensointilaitteella ja kaupallisella Multiplex-PCR-menetelmään pohjautuvalla kitillä (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification, MLPA®, MRC-Holland).
Analyysi soveltuu deleetioiden lisäksi tutkittavalla alueella esiintyvien muiden kopiolukumuutosten ja kitin valmistajan ennalta määrittelemien varianttien genotyyppaukseen.
MLPA-menetelmä on herkkä DNA:n laadulle ja eristyksessä käytetylle puskurille, joten suosittelemme analyysiin EDTA-kokoverta valmiiksi eristetyn DNA:n sijasta.
MLPA-menetelmällä ei havaita seuraavanlaisia muutoksia:

• koettimien kohdealueiden ulkopuoliset muutokset
• muutokset, joissa tutkittavien alueiden kopioluku ei muutu
• yksittäiset nukleotidimuutokset tai lyhyet insertiot/deleetiot ellei niitä ole valmistajan toimesta ennalta määritelty kuulumaan analyysiin.

Koettimien kohdealueet löytyvät kitin valmistajan verkkosivuilta (https://www.mrcholland.com, 06.10.2020) ja tarkempia tutkimuskohtaisia tietoja saa pyydettäessä Itä-Suomen Genomikeskuksen Geenidiagnostiikkalaboratoriosta.

Tulosten tulkinta
Sekvensoinnissa ja deleetioanalytiikassa havaittuja sekvenssimuutoksia verrataan tietokannoista ja kirjallisuudesta löytyviin aikaisemmin raportoituihin sekvenssimuutoksiin niiden patogeenisyyden arvioimiseksi. Variantit luokitellaan ACMG suositusten mukaisesti (Richards et al., 2015).
Tutkimusvastauksessa raportoimme löydetyt variantit, jotka ovat patogeenisia tai todennäköisesti patogeenisia (pathogenic, likely pathogenic) tai merkitsevyydeltään epävarmoja (uncertain significance). Neutraaleiksi (likely benign, benign) arvioituja sekvenssimuutoksia ei raportoida. Varianttien luokittelu voi muuttua uuden lisääntyvän tiedon myötä, jolloin tiedotamme asiasta hoitavia lääkäreitä.
Tunnetut suomalaisille tyypilliset valtavariantit ovat aiemmin kirjallisuudessa todettu patogeeniseksi.
Tutkimusvastaus toimitetaan lähettävälle lääkärille.

Laboratorion IVD-laitteiden omavalmistus
Laboratorio valmistaa omavalmistuksena in vitro -diagnostiikkaan tarkoitettuja lääkinnällisiä laitteita, jotka on rekisteröity Fimean (Lääkealan turvallisuus- ja kehittämiskeskus) kansalliseen lääkinnällisten laitteiden rekisteriin ja jotka täyttävät IVD-asetuksen EU/2017/746 artiklan 5.5 mukaiset yleiset turvallisuus- ja suorituskykyvaatimukset.

Luettelo omavalmisteisista laitteista ja vakuutus vaatimusten täyttämisestä on tässä linkissä. IVD-asetuksen mukainen laitteen määritelmä kattaa myös reagenssit ja menetelmämodifikaatiot.

Muut Geenidiagnostiikkalaboratorion diagnostisissa tutkimuksissa käytetyt laitteet/reagenssit/menetelmät ovat CE-merkittyjä.

Viitteet
Richards, S., Aziz, N., Bale, S., Bick, D., Das, S., Gastier-Foster, J., Grody, W., Hegde, M., Lyon, E., Spector, E., Voelkerding, K. and Rehm, H. (2015). Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genetics in Medicine, 17(5), pp.405-423.