Menetelmät – KiTu1

Näytemateriaali
Kiinteiden kasvainten diagnostista profilointia varten otamme vastaan FFPE (formaliinifiksoitu parafiinin valettu) -tuumorikudosblokista otettuja leikkeitä. Patologin tulee määritellä näytteen tuumorityyppi ja tuumorisoluprosentti ennen näytteen lähetystä laboratorioomme. Suositeltava tuumorisoluprosentti on vähintään 30 %. Näytteenotto ja lähetys laboratorioomme ohjeistetaan tarkemmin Näytteenlähetysohjeessa.

Diagnostinen palvelumme on akkreditoitu FFPE-tuumorikudosnäytteille, mutta Kitu1-paneelilla on mahdollista tutkia myös ituradan mutaatioita verinäytteestä. Otathan meihin yhteyttä saadaksesi lisätietoa tästä mahdollisuudesta.

DNA:n eristys
DNA eristetään FFPE-blokista otetuista leikkeistä käyttäen tähän tarkoitukseen soveltuvaa kaupallista kittiä. Eristetyn kaksijuosteisen DNA:n pitoisuus, puhtaus ja laatu tarkastetaan ennen geneettisiä analyysejä.

Uuden sukupolven sekvensointi
Eristetylle DNA:lle suoritetaan 52 geenin kohdennettu uuden sukupolven sekvensointi (Next Generation Sequencing, NGS). NGS-kirjastot valmistetaan automaattisella kirjastojen käsittelyrobotilla (Magnis NGS Prep System, Agilent) käyttäen kohdennettua hybridisaatiopohjaista SureSelect X HT2 -kittiä (Agilent).

NGS-sekvensointi perustuu massiiviseen rinnakkaissekvensointiin, jossa miljoonia lyhyitä DNA-fragmentteja monistetaan samanaikaisesti. Näytteet sekvensoidaan Illumina NextSeq 2000 -laitteistolla. Sekvensointidata käsitellään in house data-analyysipipelinellä.

Testi kattaa seuraavat 52 geeniä:

ALK, ARID1A, ARID5B, ATM, BARD1, BRAF, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CDK12, CDKN2A, CHEK1, CHEK2, CTNNB1, DICER1, EGFR, EPCAM, ERBB2, FANCL, FGFR2, FGFR3, KEAP1, KIT, KRAS, MET, MLH1, MRE11A, MSH2,MSH6, NBN, NF1, NFE2L2, NRAS, NTRK1, NTRK2, NTRK3, PALB2, PDGFRA, PIK3CA, PMS2, POLE, PPP2R2A, PTEN, RAD50, RAD51C, RAD51D, RAD54L, RET, ROS1, SMARCA4, STK11, TP53

Näistä geeneistä tutkimukseen sisältyy proteiinia koodaava alue (eksonit) sekä 10 emäsparia intronisekvenssiä eksonin molemmin puolin (silmukointialueet). Testi on suunniteltu kattamaan kohdealueen yhden emäksen muutokset (SNV, Single Nucleotide Variant) ja lyhyet insertiot ja deleetiot. Testi ei kata isoja insertioita/deleetioita, komplekseja geeni- tai kromosomitason rakennemuutoksia, translokaatioita, geenifuusioita, variantteja kohdealueen ulkopuolella, eikä alueita, joiden sekvensointi on teknisesti mahdotonta (kuten pitkät toistojaksoalueet).

Tulosten tulkinta
Sekvensoidut DNA-fragmentit rinnastetaan ihmisen referenssigenomin sekvenssiin (GRCh38), jolloin siitä poikkeavat emäkset voidaan tunnistaa. Havaittuja sekvenssimuutoksia verrataan yleisistä ja syöpäkohtaisista tietokannoista (mm. ClinVar, Cosmic, gnomAD) ja kirjallisuudesta löytyviin aikaisemmin raportoituihin sekvenssimuutoksiin niiden patogeenisuuden arvioimiseksi. Variantit luokitellaan patogeenisuuden perusteella AMP/ASCO/CAP konsensuksen mukaisesti (Li et al., 2017).

Tutkimusvastaus
Tutkimusvastauksessa raportoidaan patogeeniset tai todennäköisesti patogeeniset (pathogenic, likely pathogenic) ja merkitsevyydeltään epävarmat (uncertain significance) variantit, joiden alleelifrekvenssi (variant allele frequency, VAF) on 5 % tai suurempi. Tietyissä tapauksissa sekvensoinnin lukusyvyyden ollessa riittävä, voidaan raportoida myös alle VAF 5 % olevat patogeeniset mutaatiot. Neutraaleiksi (likely benign, benign) arvioituja sekvenssimuutoksia ei raportoida. Varianttien luokittelu voi muuttua uuden lisääntyvän tiedon myötä, jolloin tiedotamme asiasta näytteen lähettäjää.

Tutkimusvastauksessa ilmoitetaan suoritetun sekvensoinnin näytekohtainen keskimääräinen lukusyvyys ja kattavuusprosentti vähintään 100-kertaisella lukusyvyydellä. Lisäksi raportoidaan havaitun muutoksen alleelifrekvenssi (VAF) ja lukusyvyys havaitun muutoksen kohdalla. Erillisessä liitteessä esitetään geenikohtainen keskimääräinen lukusyvyys ja kattavuusprosentti 100-kertaisella ja 250-kertaisella lukusyvyydellä.

Tutkimusvastaus toimitetaan näytteen lähettäneeseen yksikköön kymmenen arkipäivän kuluessa.

Laboratorion IVD-laitteiden omavalmistus
Laboratorio valmistaa omavalmistuksena in vitro -diagnostiikkaan tarkoitettuja lääkinnällisiä laitteita, jotka on rekisteröity Fimean (Lääkealan turvallisuus- ja kehittämiskeskus) kansalliseen lääkinnällisten laitteiden rekisteriin ja jotka täyttävät IVD-asetuksen EU/2017/746 artiklan 5.5 mukaiset yleiset turvallisuus- ja suorituskykyvaatimukset.

Luettelo omavalmisteisista laitteista ja vakuutus vaatimusten täyttämisestä on tässä linkissä. IVD-asetuksen mukainen laitteen määritelmä kattaa myös reagenssit ja menetelmämodifikaatiot.

Muut Geenidiagnostiikkalaboratorion diagnostisissa tutkimuksissa käytetyt laitteet/reagenssit/menetelmät ovat CE-merkittyjä.

Viitteet
Li, M.M., Datto, M., Duncavage, E.J., Kulkarni, S., Lindeman, N.I., Roy, S., Tsimberidou, A.M., Vnencak-Jones, C.L., Wolff, D.J., Younes, A., and Nikiforova, M.N., 2017. Standards and Guidelines for the Interpretation and Reporting of Sequence Variants in Cancer: A Joint Consensus Recommendation of the Association for Molecular Pathology, American Society of Clinical Oncology, and College of American Pathologists. Journal of Molecular Diagnostics, 19 (1), p. 4 – 23. https://doi.org/10.1016/j.jmoldx.2016.10.002.